Adicione em um microtubo: 50 µg/ml do vetor (circular ou com pontas cegas) 1 µl 25 µg/ml de fragmento de PCR 8 µl 10X Tampão KGB ou Tango (Fermentas) 2 µl 10 mM ATP 1 µl 2 mM dNTPs 1 µl Enzima de Restrição (Ex: SmaI, EcoRV) 2 unidades T4 DNA polimerase 1 unidade T4 DNA ligase 3 unidades H2O ajustar para 20 µl Incube por 4 h a 22oC Extraia com clorofórmio e precipite com EtOH Resuspenda em 6 µl de H2O e eletropore metade do volume.